免疫組化技術(shù)規(guī)范

歐美國家相繼開展了免疫組化質(zhì)量控制工作，建立了一套比較完善的質(zhì)量控制方法和程序。中國病理工作者委員會(huì)（CCP）免疫組化研究中心借鑒國外的先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)并結(jié)合我國當(dāng)前的實(shí)際情況開始探索一種適合我國免疫組化質(zhì)控的方法，同時(shí)，發(fā)現(xiàn)和推廣標(biāo)準(zhǔn)化的染色程序，改善和提高免疫組化實(shí)驗(yàn)的可靠性，使免疫組化技術(shù)更具標(biāo)準(zhǔn)化，免疫組化結(jié)果更具可靠性和重復(fù)性。盡管免疫組化在許多實(shí)驗(yàn)室中已常規(guī)開展，但它是一個(gè)多步驟、多因素決定的一種實(shí)驗(yàn)方法，由于各實(shí)驗(yàn)室采用的修復(fù)方法、染色方法、試劑廠家、抗體克隆號(hào)、檢測(cè)系統(tǒng)等有所不同，染色結(jié)果會(huì)出現(xiàn)較大差異，相當(dāng)部分的實(shí)驗(yàn)室對(duì)免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化的認(rèn)識(shí)尚欠足夠重視, 致使不良的染色結(jié)果對(duì)病理診斷引起誤導(dǎo)，因此免疫組化染色結(jié)果的可靠性受到了極大的關(guān)注。

在實(shí)際工作當(dāng)中有許多因素影響著免疫組化的結(jié)果，包括技術(shù)人員是否熟練掌握整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作程序、抗體的特異性、方法的敏感性、標(biāo)本的固定、組織的處理、是否進(jìn)行抗原修復(fù)、修復(fù)液的PH值等等因素。為了讓每個(gè)實(shí)驗(yàn)室能夠持續(xù)穩(wěn)定地完成可靠的實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果，應(yīng)當(dāng)將免疫組化染色技術(shù)中的全部流程納入標(biāo)準(zhǔn)化。

一、 免疫組化成功的要素

病理科醫(yī)生要有相當(dāng)?shù)拿庖呓M化診斷知識(shí)和免疫組化技術(shù)經(jīng)驗(yàn)，要清楚認(rèn)識(shí)免疫組化技術(shù)是一門實(shí)驗(yàn)性、技術(shù)性非常強(qiáng)的技術(shù)，要多了解多種抗體在組織中的表達(dá)情況，以及影響免疫組化結(jié)果的各種因素，只有提高醫(yī)生的免疫組化診斷水平才能避免錯(cuò)誤的判斷，才能確保免疫組化診斷的準(zhǔn)確性。病理技術(shù)人員是免疫組化實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵因素，操作人員要有豐富的免疫組化的理論知識(shí)及熟練的免疫組化染色技術(shù)，十分清楚每一個(gè)步驟的應(yīng)用原理，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具可靠性。可靠的實(shí)驗(yàn)試劑和實(shí)驗(yàn)方法是每個(gè)實(shí)驗(yàn)室的*條件。由于實(shí)驗(yàn)方法多種多樣，抗體的品種繁多，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都應(yīng)當(dāng)確保高質(zhì)量?jī)r(jià)的試劑，并摸索出*的實(shí)驗(yàn)條件。的免疫組化取決于有效的抗原修復(fù)、敏感的檢測(cè)系統(tǒng)、合適的實(shí)驗(yàn)質(zhì)控對(duì)照及熟練和有責(zé)任心的技術(shù)人員。

二、免疫組化染色前處理技術(shù)操作規(guī)范

1．取材：理想的取材厚度是0.2cm～0.3cm，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都認(rèn)為組織在加熱抗原修復(fù)過程中造成脫片的主要原因是取材過厚或脫水浸蠟處理不當(dāng)所致。良好的取材、固定、脫水過程是免疫組化質(zhì)控的前提，如果H&E切片都做不出滿意的染色結(jié)果，那么免疫組化染色也將無從談起，根本無法保證染色質(zhì)量。

2．固定：在眾多的組織固定液中（如甲醛、乙醇、戊二醛、多聚甲醛 等），不同的實(shí)驗(yàn)方法在使用上各有千秋。但在保持組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、抗原可測(cè)定性、組織滲透性以及試劑的價(jià)格上，福爾馬林是、既經(jīng)濟(jì)又通用。而含酸或含汞的固定液對(duì)抗原保存均不理想。組織離體后固定一般不要超過30分鐘，在常溫條件下固定時(shí)間為8-24小時(shí)。同時(shí)還要注意避免福爾馬林過度固定造成的組織抗原丟失，有研究發(fā)現(xiàn)新鮮組織經(jīng)過福爾馬林一周固定后組織抗原丟失嚴(yán)重，抗原幾乎不能被檢測(cè)，因?yàn)榻M織固定后會(huì)引起蛋白或蛋白分子之間形成交聯(lián)，導(dǎo)致抗原位點(diǎn)遮蓋，可以通過抗原修復(fù)方法來修正，若加抗體前不采用抗原修復(fù)，則免疫組化染色常不能到達(dá)理想結(jié)果或不成功。組織同樣不能長(zhǎng)時(shí)間放置在70%的乙醇中，酒精固定后的組織形態(tài)不如福爾馬林固定的組織。脫鈣液對(duì)抗原破壞較為嚴(yán)重，因此在組織脫鈣前在福爾馬林液中固定48小時(shí)，若組織沒有固定透則酸會(huì)破壞抗原，脫鈣液中酸的濃度與脫鈣時(shí)間都必須盡量控制在zui低的限度。

3．浸蠟：我們認(rèn)為浸蠟溫度應(yīng)控制在58～60℃左右，浸蠟用的石蠟應(yīng)經(jīng)常更換，以減少石蠟中二甲苯的含量。高溫下的二甲苯容易使組織發(fā)脆，細(xì)胞收縮，更容易掉片。

4．切片厚度：用于免疫組織化學(xué)染色的切片厚度為3-4微米。為防止在染色過程中脫片，需要使用硅化玻片裱片。

5．硅化玻片的制備：載玻片經(jīng)酸洗沖洗干凈后烤干； 2%APES丙酮或*中浸泡1～2min；丙酮或*洗1～2分鐘；蒸餾水浸洗1～2min；烤干備用。

6．烤片：切片在60℃～65℃烤箱中烤片30－60分鐘左右。有些實(shí)驗(yàn)室采用烤片O。有報(bào)導(dǎo)烤片溫度超過60℃時(shí)，烤片時(shí)間超過18小時(shí)的切片，免疫組化染色強(qiáng)度比烤4小時(shí)的切片要略弱。溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)均會(huì)影響抗原的活性，原因是在高溫干燥條件下可以加速組織切片中抗原的氧化。

7．切片保存：一些實(shí)驗(yàn)室研究人員習(xí)慣將組織蠟塊連續(xù)切片后長(zhǎng)期保存在室溫條件下，切片后的組織在室溫下長(zhǎng)期保存抗原可以損失。實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)蠟塊切片后，在室溫下保存三個(gè)月以上，免疫組化染色結(jié)果會(huì)出現(xiàn)減弱或陰性情況。并進(jìn)行了新、舊切片的保存時(shí)間對(duì)照實(shí)驗(yàn)，選擇11種不同組織蠟塊每例連續(xù)切片10片，共110片，常溫空氣中放置一個(gè)月、三個(gè)月、半年、一年與新切片進(jìn)行成對(duì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：組織蠟塊切片后在室溫下保存三個(gè)月，抗原對(duì)多數(shù)抗體的敏感性約下降一半，部分切片丟失更多。切片保存半年多數(shù)的抗體不能出現(xiàn)陽性標(biāo)記結(jié)果，保存一年以上僅有個(gè)別的切片能夠有微弱的陽性表達(dá)，尤其核表達(dá)的抗原丟失更為突出。國外也有類似的資料報(bào)道。其原因可能與空氣中的氧化作用有關(guān)，所以在實(shí)際工作可以采用蠟封切片來避免抗原損失以便長(zhǎng)期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，尤其是用于科研集中實(shí)驗(yàn)的切片更應(yīng)注意切片的保存。

8．脫蠟：免疫組化的脫蠟步驟與常規(guī)H&E脫蠟步驟相同，免疫組化實(shí)驗(yàn)室中脫蠟需與H&E常規(guī)脫蠟分離，以保證脫蠟*，否則可能導(dǎo)致染色結(jié)果的異常。

三、免疫組化實(shí)驗(yàn)中的抗原修復(fù)

1．酶消化：如胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白水解酶

2．抗原熱修復(fù)：高壓法、微波法、水煮法

*，免疫組化染色中zui關(guān)鍵的莫過于抗原修復(fù)，而絕大多數(shù)常用抗體的修復(fù)是通過加熱來完成的，熱抗原修復(fù)優(yōu)于酶消化，更有效，染色結(jié)果更易一致，操作單一。

3．修復(fù)時(shí)間：既要獲得zui強(qiáng)的染色結(jié)果，又要保持組織形態(tài)的完整性。許多抗原修復(fù)存在的問題是組織固定時(shí)間過短時(shí)，強(qiáng)烈的抗原修復(fù)可引起形態(tài)破壞、脫片及組織*消化，解決的方法可采用較短時(shí)間的熱修復(fù)或減少酶的消化時(shí)間。

4．抗原修復(fù)緩沖液：有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）、 Tris (pH7-8)、EDTA(pH8.0～9.0) 、 EGTA(pH9.0) 等，檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的優(yōu)點(diǎn)是染色背景清晰，適合于大多數(shù)抗體，Tris和 EDTA兩種修復(fù)液對(duì)部分抗原修復(fù)效果較強(qiáng)，但其染色背景同時(shí)加深，如使用不當(dāng)易造成假陽性結(jié)果的判斷。目前還沒有一種抗原修復(fù)液能適合于所有的抗體，檸檬酸緩沖液（pH6.0）可作為免疫組化常規(guī)使用的抗原修復(fù)緩沖液，但也不能除外某些抗體適用于EDTA和EGTA緩沖修復(fù)液，一般抗原比較難于表達(dá)的抗體多選擇高pH值的修復(fù)液。例如：ER、PR、Bcl-2、Bcl-6、TdT、Ki-67、Cyclin D1等。

5．抗原熱修復(fù)注意事項(xiàng)：無論哪一步都不要讓切片干凅，加熱后需要冷卻15－30分鐘。充分的抗原修復(fù)是影響染色結(jié)果的*重要因素，加熱的溫度和時(shí)間可導(dǎo)致修復(fù)不足或過度修復(fù)。

6．抗原熱修復(fù)對(duì)組織中內(nèi)源性生物素的影響：抗原熱修復(fù)在增強(qiáng)抗原決定簇表達(dá)的同時(shí)，也增強(qiáng)了組織中內(nèi)源性生物素的反應(yīng)。采用卵白素-生物素（Avidin-biotin）檢測(cè)系統(tǒng)，組織中內(nèi)源性生物素容易出現(xiàn)人為假象，在加熱抗原處理?xiàng)l件*相同的陰性對(duì)照片中可以觀察到較強(qiáng)的內(nèi)源性生物素的反應(yīng)，沒有經(jīng)過熱抗原處理的切片中沒有出現(xiàn)類似的情況。在細(xì)胞漿中呈均一的細(xì)顆粒狀的淺棕色陽性，有時(shí)表達(dá)也非常強(qiáng)，與真陽性的結(jié)果表達(dá)很相似，在以往的免疫組化染色中內(nèi)源性生物素的影響對(duì)診斷造成許多的誤差，卻常常被忽略。值得提醒的是在概念上一定要十分清楚，陰性對(duì)照片必須與一抗的抗原修復(fù)處理?xiàng)l件*相同，才能準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性生物素出現(xiàn)的部位。

7．內(nèi)源性生物素封閉方法：一般在抗原修復(fù)以后，加抗體前使用卵白素進(jìn)行生物素阻斷處理，也可使用非生物素的檢測(cè)系統(tǒng)，如：EliVision、EnVision、SuperVesion等。

四、免疫組化染色實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范

1.脫蠟：二甲苯 ――→ 酒精 ――→ 蒸餾水

2．內(nèi)源性過氧化物酶的消除：采用過氧化物酶的檢測(cè)系統(tǒng)，必須進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶封閉處理。如果不進(jìn)行處理，組織中的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞會(huì)干擾染色結(jié)果的判斷。常用0.3%H2O2作用切片10分鐘，對(duì)染色結(jié)果及抗原保存都沒有影響，封閉效果比較顯著。

3．血清封閉：在加入一抗前需用二抗的正常血清進(jìn)行封閉，可以減少非特異性結(jié)合。目前使用的二步法檢測(cè)系統(tǒng)可以免去這一步驟。

4．抗體使用：已有大量的即用型抗體供實(shí)驗(yàn)室使用，廠家已進(jìn)行過多次的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，可按廠家提供的條件進(jìn)行操作。濃縮型抗體一般按照廠家提供的建議稀釋度，進(jìn)行對(duì)倍稀釋預(yù)實(shí)驗(yàn)。選定*的稀釋滴度后再進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)。染色背景深大多是抗體濃度過高所致。抗體孵育溫度一般以常溫25℃為基準(zhǔn)或37℃30分鐘，也可4℃冰箱overnight。

5．沖洗：常用的沖洗液為PBS或TBS緩沖液，要嚴(yán)格執(zhí)行沖洗步驟，防止因沖洗不凈引起的背景著色，緩沖液中加入Tween20可以增強(qiáng)沖洗效果。

6．檢測(cè)系統(tǒng)：通用的檢測(cè)系統(tǒng)有生物素標(biāo)記的ABC、SP、LSAB等，此類檢測(cè)系統(tǒng)較為經(jīng)濟(jì)，日前仍有不少醫(yī)院在使用。非生物素類檢測(cè)系統(tǒng)價(jià)錢較貴，由于不需通過生物素的結(jié)合，可以避免內(nèi)源性生物素的干擾，其特點(diǎn)：敏感、省時(shí)、方便、背景低。7．顯色系統(tǒng)：由于檢測(cè)系統(tǒng)采用的是辣根過氧化物酶，因此選擇DAB（棕色）和AEC（紅色）作為酶的底物，若采用堿性磷酸酶系統(tǒng)則選擇BCIP/NBT（藍(lán)紫色）,常規(guī)免疫組化顯色的仍然是DAB，定位清晰，易于保存。AEC不能耐受酒精及敏感性低，BCIP/NBT陽性雖鮮艷，但陽性定位不準(zhǔn)確。

8．復(fù)染：襯染步驟十分簡(jiǎn)單，但襯染的好壞對(duì)染色zui終結(jié)果的質(zhì)量影響很大。有的選用Harris蘇木素，有的用Mayer’s蘇木素，且與DAB染色對(duì)照效果，在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中使用簡(jiǎn)單方便。也有實(shí)驗(yàn)室使用甲基綠襯染襯染，但不能經(jīng)有機(jī)溶劑，容易退色。

五、染色結(jié)果的觀察

1．陽性結(jié)果應(yīng)定位在細(xì)胞相應(yīng)的部位，在細(xì)胞膜表達(dá)的抗原陽性結(jié)果應(yīng)定位在細(xì)胞膜上，在其他部位
的陽性反應(yīng)均為非特異性染色。不當(dāng)?shù)目乖迯?fù)會(huì)導(dǎo)致抗原在組織細(xì)胞中定位的改變。根據(jù)所檢測(cè)抗原的不
同，抗原分別定位在：

（1）細(xì)胞膜：如LCA和CD3、CD20等；

（2）細(xì)胞質(zhì)：如Cytokeratin 、GFAP、S100 、CgA、AFP等；

（3）細(xì)胞核：如Ki-67、ER、PR、TTF-1、HPV-Ag、Cyclin D1、TDT等。

2．組織的周邊、氣泡、刀痕、皺折等部位往往呈現(xiàn)非特異性陽性表達(dá)。

3．染色結(jié)果呈陰性并非都是抗原不表達(dá)，要考慮是否與組織中的抗原受到破壞有關(guān)。

4．組織切片背景深與下列因素有關(guān)：

（1）石蠟切片脫蠟不干凈；

（2）*抗體濃度過高或孵育時(shí)間過長(zhǎng)，溫度過高；

（3）顯色劑DAB濃度過高或H2O2太多；

（4）抗體不純；

（5）抗體孵育后切片清洗不干凈。

六、免疫組化實(shí)驗(yàn)對(duì)照

為證實(shí)抗體和檢測(cè)試劑盒效價(jià)是否可靠，染色操作是否正確，一般需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)對(duì)照，以避免試劑失效或操作失當(dāng)而出現(xiàn)假陰性和假陽性，確保染色結(jié)果的可靠性。

1．陽性對(duì)照:選用已知染色中度陽性以上的組織切片染色，陽性切片應(yīng)呈陽性，此外組織中的內(nèi)對(duì)照也是很好的陽性對(duì)照。

2．陰性對(duì)照:選用已知染色陰性的組織切片染色，其結(jié)果應(yīng)為陰性。每次實(shí)驗(yàn)中增加Vimentin染色作為對(duì)照，目的是觀察組織經(jīng)福爾馬林固定后預(yù)期抗原表達(dá)的敏感性，按福爾馬林固定后抗原損傷的程度來進(jìn)行分析。Vimentin幾乎在任何組織中都有表達(dá)，尤其適合活檢組織中的免疫組化染色觀察。在與上皮組織相連接的間質(zhì)中存在著大量的血管Vimentin可陽性表達(dá)，如果在同一張切片的間質(zhì)中出現(xiàn)Vimentin染色微弱或部分區(qū)域變?nèi)醯那闆r，表明是不當(dāng)?shù)墓潭▽?dǎo)致抗原破壞。所以在每批次實(shí)驗(yàn)中應(yīng)常規(guī)加入Vimentin染色，用于指導(dǎo)觀察福爾馬林固定后抗原表達(dá)敏感性情況。

七、抗體的保存和稀釋

一般來說，抗體應(yīng)放在4℃冰箱中保存，*抗體可分成小包裝于-20℃保存，使用時(shí)存放在4℃，不宜反復(fù)存放于4℃和-20℃之間，反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)下跌。檢測(cè)系統(tǒng)一般不宜于-20℃保存，因?yàn)榉磸?fù)凍融使得與抗體結(jié)合的酶容易分解，導(dǎo)致檢測(cè)的敏感度降低。濃縮的抗體在染色前應(yīng)根據(jù)說明書要求或自行摸索出的*工作濃度進(jìn)行稀釋。可將抗體稀釋至1：10，染色前再稀釋成工作液。濃縮液抗體保存的時(shí)間較長(zhǎng)，反之稀釋后的抗體保存的期限較短，如使用即用型抗體，經(jīng)過一定時(shí)間后應(yīng)注意其效價(jià)時(shí)否有所降低，避免出現(xiàn)假陰性染色。

Nestin、PDGFR 可用于胃腸間質(zhì)瘤的診斷指標(biāo)，尤其對(duì)CD117陰性胃腸間質(zhì)瘤在診斷上有很大的幫助，在國外已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。這兩種抗體可用于常規(guī)固定的石蠟切片，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明Nestin 用PH8.0 EDTA高壓修復(fù)，PDGFR用PH6.0 檸檬酸微波修復(fù)效果較好。